與Southern或Northern雜交方法類似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。既可以定性,又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。
細菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易著色,若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽孢呈無色透明狀)。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽孢染色法都基于同一個原則:除了用著色力強的染料外,還需要加熱,以促進芽孢著色。當染芽孢時,菌體也會著色,然后水洗,芽孢染上的顏色難以滲出,而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染,使菌體和芽孢呈現(xiàn)出不同的顏色,因而能更明顯地襯托出芽孢,便于觀察。
牛血清白蛋白是血液中的主要成分(38g/100ml),分子量68kD,等電點4.8,含氮量16%,含糖量0.08%,僅含已糖和已糖胺,含脂量只有0.2%。白蛋白由581個氨基酸殘基組成,其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵,在肽鏈的第34位有一自由巰基。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合。牛血清蛋白溶液可以作為測量蛋白質含量的標準曲線用。
注意觀察液滴落點周圍溶液顏色變化。開始時應邊搖邊滴,滴定速度可稍快(每秒3~4滴為宜),但是不要形成水流。接近終點時應改為加一滴,搖幾下,最后,毎加半滴,即搖動錐形瓶,直至溶液出現(xiàn)明顯的顏色變化,準確到達終點為止。
自然界中,質粒是在營養(yǎng)充足時出現(xiàn)的,它在結構、大小、復制方式,每個細菌的拷貝數(shù),在不同的細菌體內(nèi)的繁殖力不同,在菌種之間的轉移力等方面都會變化,可能最重要的是質粒所攜帶的特征的改變。大多數(shù)原核生物的質粒是雙鏈環(huán)狀的DNA分子;但是無論是在革蘭氏陽性還是陰性菌體內(nèi)都可以發(fā)現(xiàn)線狀質粒。質粒大小變化很大,可從幾個到數(shù)百個kb。
由于貼壁細胞貼壁生長,接觸抑制,長滿一瓶后貼壁較緊,不易取出。這時必須用胰蛋白酶或者膠原蛋白酶處理,使其分散開后取出,然后在放入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
當細胞所處溫度低于0°C時,細胞脫水,細胞中可溶性物質濃度升高,并在細胞內(nèi)形成冰晶,冰晶的大小對細胞的影響是不同的,大冰晶容易造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂,故造成復蘇出來的細胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠。因此,我們在凍存細胞的時候會采取兩個措施,一加入低溫保護劑,二,慢凍細胞。
目前多數(shù)實驗室培養(yǎng)基滅菌后會放置水浴或者烘箱中,需使用的時候拿出來直接倒板。但培養(yǎng)基靜置時間不宜過長,靜置時間一般不超過4小時。靜置時間過長,培養(yǎng)基中瓊脂可能會少量凝固,形成類似絮狀析出。
免疫熒光(Immunofluorescence,IF)原理免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質和定位,以及利用定量技術(比如流式細胞儀)測定含量。